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實(shí)驗(yàn)概要

PCR擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段。

實(shí)驗(yàn)原理

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性、退火、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。

1. 模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

2. 模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

3. 引物的延伸：DNA模板－引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性、退火、延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)增的目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl 2 、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱 Taq聚合酶。

除了典型的PCR外，人們還根據(jù)各種用途設(shè)計(jì)了各種不同的PCR。如：

RT-PCR，即在mRNA反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行的PCR。

反向PCR，常規(guī)PCR允許擴(kuò)增兩引物之間的DNA區(qū)段，而反向PCR則可以對(duì)靶DNA區(qū)段之外的兩側(cè)未知的DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。

不對(duì)稱PCR，常規(guī)PCR使用的引物濃度相同，而不對(duì)稱PCR使用的引物濃度不同，兩種引物濃度相差100倍。在最初20各循環(huán)中，主要產(chǎn)物是雙鏈DNA。當(dāng)?shù)蜐舛纫锉缓谋M后，高濃度引物引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA，單鏈DNA可用于序列測(cè)定。

主要試劑

1. DNA模板（1ng/μL）（質(zhì)粒R-pGEX-4T-1，R指代外源基因）

2. 2.5mmol/LdNTP (TaKaRa)

3. 10×PCR緩沖液(TaKaRa)

4. 25mmol/L MgCl 2 (TaKaRa)

5. 引物1、引物2（5pmol/μL）

相關(guān)儀器

PCR擴(kuò)增儀