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一、 實驗原理
聚合酶鏈式反應(yīng) ( PCR) 可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反應(yīng)結(jié)束之后,我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性的分析,也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析,分析的都是 PCR 終產(chǎn)物。但是在許多情況下,我們所感興趣的是未經(jīng) PCR 信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量 PCR 技術(shù)應(yīng)運而生。所謂的實時熒光定量 PCR 就是通過對 PCR 擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量 PCR 反應(yīng)中,引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì),隨著 PCR 反應(yīng)的進行, PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖 。
一般而言,熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段 , 熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT 值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值,它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上,但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10 倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值( threshold value )。
CT 值與起始模板的關(guān)系研究表明,每個模板的 CT 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系,起始拷貝數(shù)越多, CT 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線,其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù),縱坐標代表 Ct 值(如圖 3 所示)。因此,只要獲得未知樣品的 Ct 值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
熒光探針和熒光染料
實時熒光定量 PCR 的化學(xué)原理包括探針類和非探針類兩種,探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加,非探針類則是利用熒光染料或者特殊設(shè)計的引物來指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟,特異性更高,但后者則簡便易行。
1.SYBR Green I
SYBR Green I 是一種結(jié)合于小溝中的雙鏈 DNA 結(jié)合染料。與雙鏈 DNA 結(jié)合后,其熒光大大增強。這一性質(zhì)使其用于擴增產(chǎn)物的檢測非常理想。 SYBR Green I 的最大吸收波長約為 497nm ,發(fā)射波長最大約為 520nm 。在 PCR 反應(yīng)體系中,加入過量 SYBR 熒光染料, SYBR 熒光染料特異性地摻入 DNA 雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的 SYBR 染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與 PCR 產(chǎn)物的增加完全同步。
優(yōu)勢:SYBR Green I 在核酸的實時檢測方面有很多優(yōu)點,由于它與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合,不必因為模板不同而特別定制,因此設(shè)計的程序通用性好,且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質(zhì),通過熔點曲線分析可以識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體,因而可以、區(qū)分非特異擴增,進一步地還可以實現(xiàn)單色多重測定。此外,由于一個 PCR 產(chǎn)物可以與多分子的染料結(jié)合,因此 SYBR Green I 的靈敏度很高。但是,由于 SYBR Green I 與所有的雙鏈 DNA 相結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由解鏈曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量結(jié)果。
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2.分子信標(molecular beacon)
分子信標是一種在靶 DNA 不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中,位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中,熒光基團被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子,而是將能量傳遞給淬滅劑,這一過程稱為熒光諧振能量傳遞( FRET )。由于 " 黑色 " 淬滅劑的存在,由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來。如果第二個熒光基團是淬滅劑,其釋放能量的波長與熒光基團的性質(zhì)有關(guān)。分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中,環(huán)一般為 15-30 個核苷酸長,并與目標序列互補;莖一般 5-7 個核苷酸長,并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。熒光基團連接在莖臂的一端,而淬滅劑則連接于另一端。分子信標必須非常仔細的設(shè)計,以致于在復(fù)性溫度下,模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),模板存在時則與模板配對。與模板配對后,分子信標的構(gòu)象改變使得熒光基團與淬滅劑分開。當(dāng)熒光基團被激發(fā)時,它發(fā)出自身波長的光子。
3.TaqMan 探針
圖 6 Taqman 探針工作原理
TaqMan 探針是多人擁有的專利技術(shù)。 TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針,它的熒光與目的序列的擴增相關(guān)。它設(shè)計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的 5’ 末端,而淬滅劑則在 3’ 末端。當(dāng)完整的探針與目標序列配對時,熒光基團發(fā)射的熒光因與 3’ 端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應(yīng)時,聚合酶的 5’ 外切酶活性將探針進行酶切,使得熒光基團與淬滅劑分離。 TaqMan 探針適合于各種耐熱的聚合酶,如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶( MJ Research 公司有售)。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加,釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)量呈正比關(guān)系。
4. LUX Primers
圖 7 LUX 引物工作原理
LUX (light upon extention) 引物是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù)。目標特異的引物對中的一個引物 3’ 端用熒光報告基團標記。在沒有單鏈模板的情況下,該引物自身配對,形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),使熒光淬滅。在有目標片斷的時候,引物與模板配對,發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,產(chǎn)生特異的熒光信號(如圖 7 )。
與 Taqman 探針和分子信標相比, LUX 引物通過二級結(jié)構(gòu)實現(xiàn)淬滅,不需要熒光淬滅基團,也不需要設(shè)計特異的探針序列。因為 LUX 引物是一個相對較新的技術(shù),所以其應(yīng)用還有待實踐的檢驗。
二、實時熒光定量 PCR技術(shù)的應(yīng)用
實時熒光定量 PCR 技術(shù)是核酸定量技術(shù)的一次飛躍。運用該項技術(shù),我們可以對 DNA 、 RNA 樣品進行定量和定性分析。定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度;后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較。除此之外我們還可以對 PCR 產(chǎn)物或樣品進行定性分析:例如利用熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體,以區(qū)分非特異擴增;利用特異性探針進行基因型分析及 SNP 檢測等。目前實時熒光 PCR 技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個方面:
1. DNA 或 RNA 的絕對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測, 轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測,RNAi 基因失活率的檢測等。
2. 基因表達差異分析。例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異 ( 如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ),特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證
3. 基因分型。例如 SNP 檢測,甲基化檢測等。
隨著實時熒光定量 PCR 技術(shù)的推廣和普及,該技術(shù)必然會得到更廣泛的應(yīng)用。
三、實驗方法
1 樣品RNA的抽提
在收集到生物材料之后,最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存,則應(yīng)以液氮將生物材料急速冷凍后,儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時,將儲存于冷凍柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式破碎細胞,不可以先行解凍,以避免RNase的作用。
1. 提取組織RNA時,每50~100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解;提取細胞RNA時,先離心沉淀細胞,每5-10 ╳106個細胞加1ml Trizol后,反復(fù)用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞;貼壁細胞可直接棄培養(yǎng)基后加Trizol裂解。
2. 將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘;
3. 在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿,蓋上EP管蓋子,在手中用力震蕩15秒,在室溫下(15℃~30℃)放置2~3分鐘后,12000g(2℃~8℃)離心15分鐘;
4. 取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml的量加入異丙醇,在室溫下(15℃~30℃)放置10分鐘,12000g(2℃~8℃)離心10分鐘;
5. 棄上清,按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌,渦旋混合,7500g(2℃~8℃)離心5分鐘,棄上清;
6. 讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥;(RNA沉淀在70%乙醇中可長期保存)。
7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
2 RNA質(zhì)量檢測
1)紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(?g/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計算如下:
RNA溶于40 μl DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495μl的TE中,測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 μl,剩余RNA總量為:
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。
3 瓊脂糖凝膠電泳測定
1. 用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈,放在制膠平板上,封閉模具邊緣,架好梳子;
2. 根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠:準確稱量瓊脂糖干粉,加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi),定量加入電泳緩沖液(一般20~30 ml);
3. 放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻,加入一滴熒光染料,輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液,倒入電泳槽中,待其凝固;
4. 室溫下30~45分鐘后,凝膠完全凝結(jié),小心拔出梳子,將凝膠安放在電泳槽內(nèi);
5. 向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mm為宜,如樣品孔內(nèi)有氣泡,應(yīng)設(shè)法除去;
6. 在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液(loading buffer),混勻后,用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi);
7. 接通電源,紅色為正極,黑色為負極,切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60~100V電壓,電泳20~40min即可;
8. 根據(jù)指示劑泳動的位置,判斷是否終止電泳;
9. 電泳完畢,關(guān)上電源,在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產(chǎn)物的大小。
4 紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì),可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn),即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。
5樣品cDNA合成
①反應(yīng)體系
序號 反應(yīng)物 劑量
1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 總體積 10μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。
③取出后立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液,保存于-80℃待用。
6梯度稀釋的標準品及待測樣品的內(nèi)參基因(β-actin)實時定量PCR
①β-actin陽性模板的標準梯度制備陽性模板的濃度為1011,反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
②反應(yīng)體系如下:
標準品反應(yīng)體系
序號 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽性模板上游引物F 0.5μl
3 陽性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
管家基因反應(yīng)體系:
序號 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl
3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,反應(yīng)條件為:93℃ 2分鐘,然后93℃ 1分鐘,55℃ 2分鐘,共40個循環(huán)。(可以做預(yù)實驗,優(yōu)化實驗方案。)
7制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板
①針對每一需要測量的基因,選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。
反應(yīng)體系:
序號 反應(yīng)物 劑量
1 10× PCR緩沖液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至總體積為 25ul
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
35個PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72?C延伸5分鐘。
②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。
8待測樣品的待測基因?qū)崟r定量PCR
①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應(yīng)體系。
體系配置如下:
序號 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待測樣品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。
②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93℃2分鐘預(yù)變性,然后按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個循環(huán),最后72℃7分鐘延伸。
9實時定量PCR使用引物列表
引物設(shè)計軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯配)。
10電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色,檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
標題: 熒光定量PCR儀原理科普
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